所需材料
1、儀器:細胞計數儀、臺式離心機、CO2培養箱、倒置顯微鏡、移液槍、移液管移液器、4℃和-20℃冰箱、6孔培養板、直尺、maker筆。
2、試劑:細胞適配培養基、FBS、PBS、胰酶、樣本溶劑。
實驗步驟
1、劃線:先用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻的劃橫線,大約每隔0.5~1cm一道,橫穿過孔,每孔至少穿過5條線;
2、鋪板:處于對數生長期的細胞,胰蛋白酶消化成單細胞懸液,接種于6孔培養板;細胞鋪板6w/孔,接種原則為過夜后融合率達到100%,每孔最終的培養基總量2mL;
3、細胞培養37℃、5%CO2培養箱中培養24h;
4、劃痕:第二天用200微升槍頭比著6孔板蓋子或直尺,平行或垂直于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不能傾斜;
5、清洗:PBS沖洗細胞3次,除去劃下的細胞,加入無血清培養基;
6、拍照:擦去6孔板背后的marker橫線劃痕。4倍鏡下進行拍照,保證劃痕居中且垂直,注意背景一致,加入待測樣本,設置濃度梯度,可按0,6,12,24h時間點取樣,拍照。
7、結果分析,使用Image J軟件打開圖片后,隨機劃取6至8條水平線,計算細胞間距離的均值或者劃痕面積均值。
8、數據處理:
細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t時刻劃痕面積)/初始劃痕面積
細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細胞間距離均值-t時刻細胞間距離均值)/初始細胞間距離均值